ujian akhir semester

Nama : Tiara Nur Shinta

NIM : RRA1C110011

UJIAN AKHIR SEMESTER

MATA KULIAH       : KIMIA BAHAN ALAM

SKS                             : 2

DOSEN                      : Dr. Syamsurizal, M.Si

WAKTU                     : 22-29 Desember 2012

PETUNJUK : Ujian ini open book. Tapi tidak diizinkan mencontek, bilamana ditemukan, maka anda dinyatakan GAGAL. Jawaban anda diposting di bolg masing-masing.

1.      Jelaskan dalam jalur biosintesis triterpenoid, identifikasilah faktor-faktor penting yang sangat menentukan dihasilkannya triterpenoid dalam kuantitas yang banyak.

JAWAB:  

 
  
     

Saponin tritetpenoid tersusun atas inti triterpenoid dengan molekul karbohidrat. Dihidrolisis menghasilkan suatu aglikon yang disebut sapogenin ini merupakan suatu senyawa yang mudah dikristalkan lewat asetilasi sehingga dapat dimurnikan. Tipe saponin ini adalah turunan –amyrine. Semua senyawa ini melalui jalur asam mevalonat yang diperoleh dari asetil CoA . menjadi asetoasetil-CoA yang dikatalisasi oleh enzim asetil-CoA asetiltransferase. Selanjutnya asetoasetil-CoA berkondensasi lagi dengan satu unit asetil-CoA lainnya untuk membentuk molekul β-hidroksi-β-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) yang dikatalisasi oleh enzim HMG-CoA sintase. Proses kedua adalah reduksi HMG-CoA oleh NADPH dengan katalisasi oleh enzim HMG-CoA reduktase menjadi asam mevalonat. Pada proses berikutnya, dengan bantuan enzim mevalonat kinase dan enzim fosfomevalonat kinase, asam mevalonat dikonversi menjadi asam-5-pirofosfo-3-fosfomevalonat. Selanjutnya enzim pirofosfomevalonat dekarboksilase akan bekerja untuk merubah asam-5- pirofosfo-3-fosfomevalonat menjadi isopentenil pirofosfat (IPP). Dalam proses selanjutya IPP dengan bantuan enzim IPP isomerase akan membentuk reaksi kesetimbangan menjadi dimetilalil pirofosfat (DMAPP). Kondensasi IPP dan DMAPP yang akan membentuk geranil pirofosfat (GPP, C-10) dan farnesil pirofosfat (FPP, C-15) yang dikatalisasi oleh geranil pirofosfat sintase dan fenesil pirofosfat sintase berturut-turut. Reaksi-reaksi selanjutnya dari senyawa antara GPP, FPP untuk menghasilkan senyawa-senyawa triterpenoid satu persatu hanya melibatkan beberapa jenis reaksi sekunder pula. Reaksi-reaksi sekunder ini lazimnya ialah hidrolisa, siklisasi, oksidasi, reduksi dan reaksi-reaksi spontan yang dapat berlangsung dengan mudah dalam suasana netral dan pada suhu kamar, seperti isomerisasi, dehidrasi, dekarboksilasi dan sebagainya.

Menurut saya faktor yang mempengaruhi hasil dari biosintesis triterpenoid adalah enzim HMG-CoA sintase, enzim HMG-CoA reduktase, enzim mevalonat kinase dan enzim fosfomevalonat kinase, enzim pirofosfomevalonat dekarboksilase enzim IPP isomerase terutama enzim IPP isomerase karena enzim ini yang membantu terbentuknya penggabungan antara Isopentenil pirofosfat (IPP) yang selanjutnya berisomerisasi menjadi Dimetil alil pirofosfat (DMAPP). Dimana semua enzim-enzim ini berperan penting dalam biosintesis triterpenoid ini karena dengan adanya bantuan enzim ini maka dapat diketahui senyawa triterpenoid tersebut, enzim itu sendiri merupakan biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia organik.Molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk. Dan faktor selanjutnya yang mempengaruhi hasil biosintesis ini adalah Reaksi-reaksi sekunder ini lazimnya ialah hidrolisa, siklisasi, oksidasi, reduksi dan reaksi-reaksi spontan yang dapat berlangsung dengan mudah dalam suasana netral dan pada suhu kamar, seperti isomerisasi, dehidrasi, dekarboksilasi dan sebagainya.

2.      Jelaskan dalam penentuan struktur flavonoid, kekhasan signal dan intensitas serapan dengan menggunakan spektrum IR dan NMR. Berikan dengan contoh sekurang-kurangnya dua struktur yang berbeda.

JAWAB:

Flavonoid terutama berupa senyawa yang larut dalam air. Mereka dapat diekstraksi dengan alkohol 70% dan tetap ada pada lapisan air setelah ekstrak dikocok dengan eter minyak bumi. Flavonoid berupa senyawa fenol, karena itu warnanya berubah bila di tambah basa atau amoniak, jadi flavonoid mudah dideteksi pada kromatogram atau dalam larutan.

Flavonoid mengandung sistem aromatik yang terkonyugasi dan karena itu menunjukan pita serapan kuat pada spektrum UV dan spektrum tampak. Flavonoid umumnya terdapat dalam tumbuhan, terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid.

Menurur saya kekhasan dari penentuan struktur terletak dari daerah pita serapan yang terdapat pada suatu senyawa tersebut, dimana dengan adanya alat ini dapat digunakan untuk menentukan struktur tampak pada daerah yang mempunyai ciri khas yang spesifik. Didalam hal ini terdapat tiap gugus suatu senyawa yang mempunyai daerah signal tersendiri, dimana pada setiap spektrum IR dapat diketahui jarak daerah serapan yang terdapat pada senyawa tersebut sedangkan pada spektrum NMR dapat diketahui strukturnya. Untuk mengetahui spektrum ini dapat diketahui berupa gambar.

Contoh :

1.      Identifikasi untuk mengetahui pola spektrum antosianin menggunakan spektrofoto-meter UV-Vis dilakukan dengan cara ekstrak kulit buah manggis ditotolkan pada lempeng kromatografi lapis tipis (KLT) preparatif kemudian dielusi menggunakan fase gerak BAA (4: 1 : 5). Pada hasil Spektrum UV-Vis hasil KLT preparatif, dihasilkan puncak panjang gelombang maksimal  pada 279 nm, 317 nm dan 525 nm . Puncak pada panjang gelombang 279 nm dan 525 nm menunjukkan ciri dari senyawa antosianin. Kandungan Antosianin pada kulit manggis termasuk jenis sianidin  (3,5,7,3',4')-3-glukosida yang memiliki panjang gelombang maksimal 275 nm dan 523 nm
 

2.      Senyawa 1   memperlihatkan   warna   magenta   dengan   Mg/HCl   dan
memperlihatkan pita serapan UV yang spesifik flavonoid. Spektrum UV dari
senyawa dalam metanol memperlihatkan  2 pita serapan yang paling jelas
yaitu pada 260nm (pita II) dan 380nm (pita I) yang spesifik untuk kelompok
flavonol. Spektrum H-NMR juga mendukung struktur flavonol dan menunjukkan
adanya proton H-6, H-8, H-2’, H-5’, dan proton H-6’.   Spektrum PMR dari
senyawa  dalam  DMSO-d₆  memperlihatkan  dua  kelompok  resonansi  yang
berbeda.  Spektrum  tersebut  menunjukkan  dua  doublet  pada  δ  7.78  (1H,
J=1.8Hz) dan δ 6.95 (1H, J=9Hz) , satu doublet dari doublet-doublet pada   δ  7.65 (1H,  J=9, 1.8Hz),  menunjukkan  karaketristik  cincin  benzene  1,2,4-
 
 
 

3.      Dalam isolasi alkaloid, pada tahap awal dibutuhkan kondisi asam atau basa. Jelaskan dasar penggunaan reagen tersebut, dan berikan contohnya sekurang-kurangnya tiga macam alkaloid.

JAWAB :

Menurut saya kebanyakan alkaloid dibutuhkan dalam kondisi basa, karena alkaloid ini merupakan senyawa organik yang terdapat dialam bersifat basa atau alkali dan sifat basa ini disebabkan adanya atom N (nitrogen) dalam molekul senyawa tersebut pada struktur lingkar heterosiklik atau aromatis. Dan sifat kimia dari alkaloid ini yang paling penting adalah kebasaannya.

Umumnya isolasi bahan bakal sediaan galenik yang mengandung alkaloid dilakukan dengan beberapa cara, yaitu :

1.      Dengan menarik menggunakan pelarut-pelarut organik berdasarkan azas Keller. Yaitu alkaloida disekat pada pH tertentu dengan pelarut organik. Prinsip pengerjaan dengan azas Keller yaitu alkaloida yang terdapat dalam suatu bakal sebagai bentuk garam, dibebaskan dari ikatan garam tersebut menjadi alkaloida yang bebas. Untuk itu ditambahkan basa lain yang lebih kuat daripada basa alkaloida tadi. Alkaloida yang bebas tadi diekstraksi dengan menggunakan pelarut –pelarut organic misalnya Kloroform. Tidak dilakukan ekstraksi dengan air karena dengan air maka yang masuk kedalam air yakni garamgaram alkaoida dan zat-zat pengotor yang larut dalam air, misalnya glikosida-glikosida, zat warna, zat penyamak dan sebagainya. Yang masuk kedalam kloroform disamping alkaloida juga lemaklemak, harsa dan minyak atsiri. Maka setelai alkaloida diekstraksi dengan kloroform maka harus dimurnikan lagi dengan pereaksi tertentu. Diekstraksi lagi dengan kloroform. Diuapkan, lalu didapatkan sisa alkaloid baik dalam bentuk hablur maupun amorf. Ini tidak berate bahwa alkaloida yang diperoleh dalam bentuk murni, alkaloida yang telah diekstaksi ditentukan legi lebih lanjut. Penentuan untuk tiap alkaloida berbeda untuk tiap jenisnya. Hal-hal yang harus diperhatikan pada ekstraksi dengan azas Keller, adalah :    

a.       Basa yang ditambahkan harus lebih kuat daripada alkaloida yang akan dibebaskan dari ikatan garamnya, berdasarkan reaksi pendesakan.

b.      Basa yang dipakai tidak boleh terlalu kuat karena alkaloida pada umumnya kurang stabil. Pada pH tinggi ada kemungkinan akan terurai, terutama dalam keadaan bebas, terlebih bila alkaloida tersebut dalam bentuk ester, misalnya : Alkaloid Secale, Hyoscyamin dan Atropin.

c.       Setelah bebas, alkaloida ditarik dengan pelarut organik tertentu, tergantung kelarutannya dalam pelarut organik tersebut.

Dibawah ini adalah jenis-jenis pereaksi yang digunakan dalam alkaloid:

a.       Gugus Amin Sekunder

Reaksi SIMON : larutan alkaloida + 1% asetaldehid + larutan na.

nitroprussida = biru-ungu.

Hasil cepat ditunjukkan oleh Conilin, Pelletierin dan Cystisin.

Hasil lambat ditunjukkan oleh Efedrin, Beta eucain, Emetin, Colchisin dan Physostigmin.

b.      Gugus Metoksi

Larutan dalam Asam Sulfat + Kalium Permanganat = terjadi formaldehid, dinyatakan dengan reaksi SCHIFF. Kelebihan Kalium Permanganat dihilangkan dengan Asam Oksalat.

Hasil positif untuk Brucin, Narkotin, koden, Chiksin, Kotarnin, Papaverin, Kinidin, Emetin, Tebain, dan lain-lain

c.       Gugus Alkohol Sekunder

Reaksi SANCHES : Alkaloida + Larutan 0,3% Vanilin dalam HCl pekat, dipanaskan diatas tangas air = merah-ungu.Hasil positif untuk Morfin, Heroin, Veratrin, Kodein, Pronin, Dionin, dan Parakonidin.

d.   Gugus Formilen

Reaksi WEBER & TOLLENS :

Alkaloida + larutan Floroglusin 1% dalam Asam Sulfat (1:1),

panaskan = merah.

Reaksi LABAT :

Alkaloida + Asam Gallat + asam Sulfat pekat, dipanaskan diatas tangas air = hijau-biru.

Hasil positif untuk Berberin, Hidrastin, Kotarnin, Narsein, Hidrastinin, narkotin, dan Piperin.

 e.  Gugus Benzoil

Reaksi bau : Esterifikasi dengan alcohol + Asam Sulfat pekat = bau ester.

Hasil positif untuk Kokain, Tropakain, Alipin, Stivakain, Beta eukain, dan lain-lain.

 f.   Reaksi GUERRT

Alkaloida didiazotasikan lalu + Beta Naftol = merah-ungu.

Hasil positif untuk kokain, Atropin, Alipin, Efedrin, tropakain, Stovakain, Beta eukain, dan lain-lain.

g.   Reduksi Semu

Alkaloida klorida + kalomel + sedikit air = hitam Tereduksi menjadi logam raksa.

Raksa (II) klorida yang terbentuk terikat dengan alkaloid sebagai kompleks.

Hasil positif untuk kokain, Tropakain, Pilokarpin, Novokain, Pantokain, alipin, dan lain-lain.

h.   Gugus Kromofor

· Reaksi KING :

Alkaloida + 4 volume Diazo A + 1 volume Diazo B + natrium Hidroksida = merah intensif. Hasil positif untuk Morfin, Kodein, Tebain dan lain-lain.

· Reaksi SANCHEZ :

Alkaloida + p-nitrodiazobenzol (p-nitroanilin + Natrium Nitrit + Natrium Hidrolsida) = ungu kemudian jingga. Hasil positif untuk alkaloida opium kecuali Tebain, Emetin, Kinin, kinidin setelah dimasak dengan Asam Sulfat 75%.

Contoh :

1.      Isolasi tumbuhan jambu keling

Bagian tumbuhan Jambu Keling yang digunakan adalah bagian daun, bagian yang akan di ketahui kandungan senyawanya, Bagian daun tumbuhan jambu keling didestruksi basah dengan HCl dalam metanol, kemudian dinetralisasi dengan penambahan basa NH₄OH sehingga didapat Padatan berupa Endapan  selanjutnya Endapan dikeringkan dan diekstraksi. Kemudian hasil tersebut direndam dalam khloroform dan dipekatkan dengan alat rota-evaporator. Selanjutnya dilakukan pemisahan dan pemurnian yaitu Ekstrak pekat khloroform pada Kromatografi kolom dan untuk Fraksi dengan Rf sama dan positif dengan pereaslsi Maeyer  kemudian dilakukan rekristalisasi sehingga didapat Kristal murni. Selanjutnya kristal tersebut di Analisis spektroskopi dan dilakukan Penentuan titik leleh kemudian didapat Hasil pengamatan Kristal yang diperoleh berwarna kuning dan  Titik leleh = 293^oC – 295^oC.

2.      Isolasi daun brotowali

Sebanyak 100 g serbuk daun brotowali diekstrak secara maserasi menggunakan pelarut methanol dengan perbandingan 1:3 (b/v) selama 3x24 jam. Kemudian, hasil yang diperoleh disaring dengan penyaring Buchner, lalu diuapkan dengan evaporator Buchi, sehingga diperoleh ekstrak metanol kental. Selanjutnya, ekstrak metanol kental diekstrak cair-cair dengan pelarut petroleum eter (fraksi 40-60 hasil distilasi dari p.e. teknis) dengan perbandingan 1:1 (v/v), hingga diperoleh ekstrak metanol bebas minyak. Ekstrak metanol bebas minyak diasamkan dengan asam klorida 2 N sampai tercapai pH 2. Kemudian diekstrak kembali dengan pelarut petroleum eter. Lalu, larutan HCl 2 N hasil ekstraksi tersebut dibasakan dengan larutan ammonium hidroksida sampai pH ~ 10. Selanjutnya, diekstrak dengan kloroform. Lapisan kloroform dipisahkan, lalu diuapkan sehingga diperoleh ekstrak alkaloid kasar (crude alkaloid).

Identifikasi awal adanya kandungan senyawa alkaloid dilakukan dengan uji warna terhadap ekstrak metanol dan petroleum eter dengan pereaksi Dragendorff dan pereaksi Mayer. Pada uji warna dengan pereaksi Dragendorff, ekstrak ditotolkan pada plat KLT, kemudian disemprot dengan reagen. Sedangkan, uji warna dengan pereaksi Mayer dilakukan dengan cara sejumlah kecil ekstrak metanol dan petroleum eter dilarutkan dalam reagen.

3.      Isolasi kafein dari daun teh

Untuk mengisolasi kafein dari daun the kering , 25 gram daun teh kering  ditambahkan 20 gram Na₂CO₃ dan ditambahkan 275 ml air mendidih. Na2CO3 merupakan garam non-polar, yang dapat terurai didalam air menjadi ion Na+ yang mengikat kafein dan CO3- yang mengikat H2O membentuk HCO3 (sutau asam). Garam kafein + Na larut dalam air. Air mendidih yang ditambahkan berfungsi membuka pori-pori dari daun the agar ekstrak daun the dapat keluar dengan sempurna dan kafein yang didapatkan cukup banyak. Larutan bersifat basa karena panambahan Na₂CO₃ yang bresifat basa. Larutan dimasukkan kedalam corong pisah dan ditambahkan 30 ml diklorometan, dikocok kemudian didiamkan , panambahan dikloromaetan berfungsi mengikat kafein yang tadinya berbentuk garam dengan Na+ menjadi berikatan dengan diklorometan, sebab kepolaran kafein hampir sama dengan diklorometan tersebut sehingga kelarutan kafein cukup besar didalam diklorometan (140 mg/l) sementara kelarutan kafein didalam air lebih rendah (22 mg/l). Adanya perbedaan kelarutan, maka terbentuk dua lapisan pada corong pisah, lapisan atas adalah lapisan air dan lapisan bawah adalah larutan diklorometan-kafein.

Penambahan MgSO₄ anhidrat, anhidrat sendiri berarti tanpa air sehingga fungsi MgSO₄ anhidrat ini adalah untuk mengikat air yang masih terbawa dalam larutan diklorometan kaefin, setalah itu didestilasi diatas penangas air. Destilasi ini berfungsi untuk menghilangkan diklorometan (titih didih 80 ⁰C) dan meninggalkan residu kristal berwarna putih kekuningan , dimana kristal tersebut merupakan kafein yang masih kotor. Lalu kedalam kristal ditambahkan aseton panas, aseton ini berfungsi melarutkan kafein dan pengotor yang masih tertinggal, kemudian ditambahkan n-heksana untuk mengikat aseton dan pengotor. Aseton panas merupakan pelarut yang bersifat semi polar namun lebih cenderung ke polar, sehingga aseton dapat berikatan dengan baik dengan n-heksana. Pengkristalan kafein terjadi karena hanya kafein yang bersifat nonpolar dalam campuran tersebut, kristal disaring dengan corong Buchner yang dilapisi dengan kertas saring lalu dipanaskan. Pemanasan pada kristal murni dimaksudkan untuk mendapatkan kristal murni yang kering.

Selanjutnya, pengujian alkaloid untuk kristal yang diperoleh, diambil 10 mg kristal lalu dilarutkan dengan sedikit air kemudian ditambahkan 1-2 tetes pereaksi dragendorf dan menghasilkan larutan berwarna jingga yang menunjukkan adanya alkaloid.

4.      Jelaskan keterkaitan diantara biosintesis, metode isolasi dan penentuan struktur senyawa bahan alam . Berikan contohnya.

JAWAB :

1.      Biosintesis ini merupakan proses pembentukan dan peenguraian di mana reaksi kimia dihasilkan dari pada bahan yang akan uji. Dimana biosintesis tidak seperti sintesis kimia karena biosintesis ini berlaku dalam organisme hidup yang dibantu  oleh enzim yang sebagiannya metabolisme dalam proses ini.

2.      isolasi senyawa kimia dari bahan alam adalah sebuah usaha bagaimana caranya memisahkan senyawa yang bercampur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang murni. salah satu usaha mengefektifkan isolasi senyawa tertentu maka dapat dimanfaatkan pemilihan pelarut organik yang akan digunakan pada isolasi tersebut, dimana pelarut polar akan lebih mudah melarutkan senyawa polar dan sebaliknya senyawa non polar lebih mudah larut dalam pelarut non polar. Dengan kata lain, pemilihan pelarut harus disesuaikan dengan sifat-sifat senyawa yang akan dimurnikan. Isolasi berdasarkan sifat kimia dan  kereaktifan bahan alam terhadap pelarut tertentu. Bahan alam diisolasi melalui reaksi kimia dan dipisahkan dari senyawa lain yang tidak bereaksi. Dan isolasi ini juga merupakan sebuah usaha bagaimana caranya memisahkan senyawa yang bercampur sehingga kita dapat menghasilkan senyawa tunggal yang murni. Tumbuhan mengandung ribuan senyawa yang dikategorikan sebagai metabolit primer dan metabolit sekunder. Biasanya proses isolasi senyawa dari bahan alami ini mentargetkan untuk mengisolasi senyawa metabolit sekunder, karena senyawa metabolit sekunder diyakini dan telah diteliti dapat memberikan manfaat bagi kehidupan manusia.

3.      Penentuan struktur dilakukan dengan alat spektroskopi, dimana pada metode spektroskopi ini digunakan untuk menentukan dan mengkonfirmasi struktur molekul dan meninjau reaksi untuk mengetahui kemurnian dari senyawa tersebut. Spektrokopi terdiri dari berbagai macam yaitu :

a.       Spektroskopi emisi

b.      Spectroskopi absorbsi

c.       NMR Spektroskopi

d.      Spektroskopi Infra Merah

Dari pengertian diatas menurut saya hubungan antara biosintesis,isolasi dan penentuan struktur adalah Pada jalur biosintesis dapat mengetahui senyawa yang sederhana menjadi senyawa yang kompleks dan mendapatkan metabolit sekunder, serta tahap-tahap yang digunakan untuk menghasilkan proses dari suatu senyawa serta hasil biosintesis didapatkan suatu senyawa yang murni. Kemudian senyawa murni tersebut dilanjutkan dengan melakukan suatu isolasi dari suatu senyawa dimana isolasi merupakan suatu cara untuk memisahkan suatu komponen yang terdapat pada suatu senyawa sehingga mendapatkan senyawa yang murni sehingga bebas dari zat pengotor  pada suatu senyawa, dimana dari hasil isolasi ini terdapat senyawa yang benar-benar murni yaitu berupa residu yang telah murni. Hasil dari isolasi yang telah murni dapat ditentukan struktur dengan menggunakan alat yang bernama spektroskopi yaitu untuk mengetahui daerah serapan maupun penetuan struktur.

Contoh :

Disini saya mengambil contoh pada biosintesis, isolasi dan penentuan struktur terhadap kafein

Kafeina atau lebih populernya kafein, ialah senyawa alkaloid xantina berbentuk kristal dan berasa pahit.

1.      Biosintesis kafein

2.      Isolasi kafein

25  g daun  teh kering dan  20 g  natrium karbonat  dimasukkan  ke  dalam labu. Erlenmeyer 250 mL, kemudian tambahkan 225 mL air mendidih. Diamkan selama 7 menit, kemudian didekantasi ke dalam labu Erlenmeyer lain. Ke dalam daun teh ditambahkan 50 mL air mendidih, kemudian ekstrak teh segera didekantasi dan digabungkan dengan ekstrak sebelumnya.Untuk mengekstrak sisa kafein yang mungkin ada, air berisi daun teh dididihkanselama 20 menit, kemudian ekstraknya didekantasi. Ekstrak teh didinginkan hingga suhu kamar, kemudian, lakukan ekstraksi di dalam corong pisah dengan penambahan 30 mL diklorometana. Corong pisah dikocok secara perlahan selama 5 menit (supaya tidak terbentuk emulsi) dan sesekali keran corong pisah dibuka untuk mengurangi tekanan udara dalam corong. Ekstraksi diulang dengan penambahan 30 mL diklorometana ke dalam corong pisah. Ekstrak diklorometana dan semua fraksi yang berwujud emulsi digabungkan di dalam labu Erlenmeyer 125 mL, kemudian tambahkan kalsium klorida anhidrat ke dalam gabungan ekstrak dan emulsi, sambil diaduk  dan digoyang selama 10 menit. Kemudian, ekstrak diklorometana disaring dengan penyaringan biasa. Erlenmeyer dan kertas saring dibilas dengan 5 mL diklorometana. Filtrat digabung dan lakukan distilasi menggunakan penangas air untuk menguapkan diklorometana. Produk yang terbentuk ditimbang dan dilakukan rekristalisasi menggunakan 5 mL aseton panas, lalu  larutan  ini  dipindahkan  dengan  pipet  ke  dalam  labu  Erlenmeyer  kecil.  Masih  dalam  keadaan  panas,  tambahkan ,n-heksana tetes demi tetes sampai  terbentuk  kekeruhan. Dinginkan sampai  mencapai suhu kamar, kemudian kristal yang terbentuk disaring dengan penyaringan isap (vakum). Kristal dicuci dengan  beberapa  tetes  n-heksana.  Kemudian  dilakukan  pengujian titik leleh. 

3.      Penentuan struktur