ISOLASI ALKALOID

ISOLASI SENYAWA ALKALOID DARI EKSTRAK METANOL DAUN BROTOWALI (Tinospora crispa (L.) Diels)

Sebanyak 1 kg daun brotowali dibersihkan, lalu dikering-anginkan sampai kering. Selanjutnya, sampel daun brotowali kering dihaluskan dengan blender untuk mendapatkan serbuk daun brotowali.

Proses Ekstraksi

Sebanyak 100 g serbuk daun brotowali diekstrak secara maserasi menggunakan pelarut methanol dengan perbandingan 1:3 (b/v) selama 3x24 jam. Kemudian, hasil yang diperoleh disaring dengan penyaring Buchner, lalu diuapkan dengan evaporator Buchi, sehingga diperoleh ekstrak metanol kental. Selanjutnya, ekstrak metanol kental diekstrak cair-cair dengan pelarut petroleum eter (fraksi 40-60 hasil distilasi dari p.e. teknis) dengan perbandingan 1:1 (v/v), hingga diperoleh ekstrak metanol bebas minyak.

Ekstrak metanol bebas minyak diasamkan dengan asam klorida 2 N sampai tercapai pH 2. Kemudian diekstrak kembali dengan pelarut petroleum eter. Lalu, larutan HCl 2 N hasil ekstraksi tersebut dibasakan dengan larutan ammonium hidroksida sampai pH ~ 10. Selanjutnya, diekstrak dengan kloroform. Lapisan kloroform dipisahkan, lalu diuapkan sehingga diperoleh ekstrak alkaloid kasar (crude alkaloid).

http://pradina21.blogspot.com/2011/05/isolasi-senyawa-alkaloid-dari-ekstrak.html

ISOLASI FLAVONOID

Metode terbaik untuk mengisolasi atau memisahkan campuran flavonoid antara lain dengan kromatografi kertas (KKt) dan kromatografi lapis tipis (KLT). Jika menggunakan metode KKt, kertas yang disarankan adalah kertas Whatman 3MM (46 x 57 cm) atau yang setara. Kertas dibuat seperti gambar di bawah. Ekstrak ditotolkan kira-kira 8 cm dari tepi lipatan pertama dan 3 cm dari lipatan kedua dengan garis tengah 3 cm yang berpusat pada satu titik. Pengeringan bercak dibantu dengan pengering rambut. Ekstrak yang ditotolkan dapat digunakan secara umum yaitu dari sejumlah ekstrak yang diperoleh dari 50 – 100 mg bahan tumbuhan kering. Elusi pertama dapat digunakan pengembang beralkohol, misalnya BAA (n-Butanol, Asam asetat, Air = BAW) 4:1:5 atau TBA (t-BuOH:HOAc:H₂O) 3:1:1. Kertas diangkat dan dikeringkan di lemari asam, bagian kromatogram yang dilipat (a) digunting. Selanjutnya eluen kedua menggunakan pengembang, biasanya berupa larutan dalam air seperti asam asetat 15%. Untuk antosianin disarankan pengembang setara , biasanya BAA atau Bu/HCl dan kedua HCl 1%.

Flavonoid tidak nampak pada kertas kromatogram, kecuali antosian (bercak jingga sampai lembayung yang menjadi biru dengan uap ammonia), khalkon, auron dan 6-hidroksi flavanol kuning). Karena alasan tersebut, untuk mendeteksi bercak, kromatogram diperiksa dengan sinar UV (366 nm dan 254 nm) dan dapat diperjelas dengan uap ammonia.

Untuk isolasi flavonoid skala besar dapat dilakukan dengan kromatografi kolom. Pada dasarnya, cara ini meliputi penempatan campuran flavonoid (berupa larutan) di atas kolom yang berisi serbuk penjerap (seperti selulosa, silika, atau poliamida), dilanjutkan dengan elusi beruntun setiap komponen memakai pelarut yang sesuai. Kolom hanya berupa tabung kaca yang dilengkapi dengan keran pada salah satu ujungnya dengan ukuran garis tengah berbanding panjang kolom 1:10 atau 1:30.

Mengemas kolom dilakukan dengan hati-hati agar dihasilkan kolom yang homogen. Jika kolom tidak memiliki kaca masir, maka dapat diganakan kaca wol atau kapas, sumbat ini direndam dengan pengelusi yang tingginya kira-kira 10 cm. Kemasan kolom dibuat bubur dengan pelarut yang sama, lalu dituang dengan hati-hati ke dalam kolom tanpa terputus-putus agar tidak terbentuk lapisan. Kemasan dibiarkan turun dan kelebihan pelarut dibiarkan turun. Jika fase diam poliamida yang digunakan maka dianjurkan untuk mengembangkan dulu satu jam.

Selanjutnya larutan cuplikan ditempat di atas kemasan sedemikian rupa sehingga berupa satu pita, usahakan menggunakan pelarut sesedikit mungkin untuk memperoleh hasil yang baik. Biarkan larutan cuplikan meresap ke dalam kemasan dengan membuka sedikit keran dan setelah cuplikan terbuka, keran ditutup dan ditambahkan perlahan-lahan cairan pengelusi dan dibiarkan kembali meresap ke dalam kemasan.

http://fille.blogspot.com/2012/04/isolasi-flavanoid.html

ISOLASI SENYAWA TERPENOID

ISOLASI SENYAWA TERPENOID
DARI DAUN TANAMAN NILAM (pogostemon heyneanus, benth)

 Cara kerja
penelilti ini meliputi empat tahap pengerjaan yaitu ekstraksi, fraksinasi, pemurnian dan karakterisasi.

a.       Ektraksi
sampel daun direndam (maserasi ) dengan menggunakan metanol + 3-4 hari. Setelah itu maserat yang diperoleh dikumpulkan, disaring, dan dipekatkan dengan penguap bertekanan rendah hingga diperoleh residu yang kering. Selanjutnya ekstrak yang diperoleh dipartisi dengan menggunakan etil asetat : air = 1 :1 sebanyak 3 kali menghasilkan 2 fase yaitu fase etil asetat dan fase air. Selanjutnya dilakukan uji reaksi liberan buchard terhadap kedua fase. Dari uji kedua fase diketahui fase etil asetat yang lebih memberikan hasil positif atau yang mengandung senyawa terpenid. Kemudian dilakukan evaporasi terhadap fase vetil asetat sehingga diperoleh ekstrak kental.

b.       Fraksinasi.
Pada tahap ini dilajutkan dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT) dengan menggunakan beberapa campuran pelarut yang dilakukan terhadap ekstrak etil asetat untuk melihat komposisi dan sistem pelarut yang tepat yang akan digunakan dalam fraksinasi pada kromatografi kolom. Sistem pelarut antara lain : n-heksan : etil asetat = 2 : 1, metanol : air = 5 : 1, kloroform : metanol : air= 7 : 3 : 1. setelah diuji hasil KLT dan diperoleh sistem pelarut- ekstrak yang tepat , selajutnya dilakukan pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak dengan kromatografi kolom. Sampel ekstrak yang mungkin selanjutnya dilarutkan dengan kloroform untuk dihomogenkan dan setelah cukup kering dimasukkan kedalam kolom danm dielusi dengan campuran n-heksan : etil asetat menurut kenaikan gradien poleritas pelarut, mulai dari perbandingan 10 :1 sampai dengan 1 :1. selanjutnya dilakukan kromatohgrafi lapis tipis terhadap masing-masing komponen sehingga dihasilkan beberapa macam fraksi. Fraksi-fraksi yang mempunyai nilai Rf yang sama digabung menjadi satu fraksi.

c.        Pemurnian
Fraksi yang telah dikumpulkan tadi, selajunya diuapkan kemudian dilakuakan rekristalisasi. Padatan komponen tersebut dilarutkan dengan pelarut methanol pada suhu 50o C, kemudian disaring dengan corong buchner selagi panas. Jika larutan berwarna, ditambahkan norit 1-2% dari berat padatan komponen tadi, kemudian disaring kembali dan filtratnya didinginkan dalam air es sampai terbentuk kristal.

d.       Karakterisasi
kristal yang diperoleh uji kemurniannya dengan kromatografi lapis tipis dalam eluen n-heksan : etil asetat (2:1) dilanjutkan dengan pengujian titik leleh dan diidentifikasi dengan uji pereaksi Liberman – Buchard.

http://buyungchem.wordpress.com/isolasi-senyawa-terpenoid/

Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Terpenoid

 METODE KERJA

   Ekstraksi

Ekstraksi senyawa terpenoid dilakukan dengan dua cara yaitu :

a.       Sokletasi

Seberat 1000 g serbuk kering herba meniran disokletasi dengan 5 L pelarut n –heksana. Ekstrak n-heksana dipekatkan lalu disabunkan dalam 50 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksana dikentalkan lalu diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri.

b.      Maserasi

Seberat 1000 g serbuk kering herba meniran dimaserasi menggunakan pelarut metanol. Ekstrak metanol dipekatkan lalu dihidrolisis dalam 100 mL HCl 4 M. Hasil hidrolisis diekstraksi dengan 5 x 50 mL n–heksana. Ekstrak n-heksana dipekatkan lalu disabunkan dalam 10 mL KOH 10%. Ekstrak n-heksana dikentalkan lalu diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri.

Ekstrak yang positif terpenoid dan paling aktif antibakteri dipisahkan mengunakan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel 60 dan fase gerak kloroform : metanol (3 : 7). Fraksi-fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom diuji fitokimia dan uji aktivitas antibakteri. Fraksi yang positif terpenoid dan paling aktif antibakteri dilanjutkan ke tahap pemurnian menggunakan kromatografi lapis tipis. Isolat yang relatif murni selanjutnya diidentifikasi menggunakan kromatogafi gas – spektroskopi massa.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil ekstraksi dengan cara sokletasi dan maserasi menunjukkan bahwa ekstrakn-heksana pada kedua cara tersebut positif mengandung senyawa terpenoid. Hal ini dibuktikan dengan terbentuknya warna ungu setelah ekstrak nheksana direaksikan dengan Pereaksi Lieberman Burchard. Hasil uji aktivitas antibakteri terhadap ekstrak n-heksana hasil sokletasi memberikan daya hambat yang lebih besar dibandingkan ekstrakn-heksana hasil maserasi. Uji aktivitas bakteri dilakukan dengan pembiakan bakteri dengan menggunakan jarum ose yang dilakukan secara aseptis. Lalu dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 2mL Muller-Hinton broth kemudian diinkubasi bakteri homogen selama 24 jam pada suhu 35°C. suspensi baketri homogeny yang telah diinkubasi siap dioleskan pada permukaan media Muller-Hinton agar secara merata dengan menggunakan lidikapas yang steril. Kemudian tempelkan disk yang berisi sampel, standartetrasiklin serta pelarutnya yang digunakan sebagai kontrol. Lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35°C. dilakukan pengukuran daya hambat zat terhadap baketri.

Terhadap ekstrak n-heksana hasil sokletasi dipisahkan mengunakan kromatografi kolom menghasilkan tiga buah fraksi yang dipaparkan pada Tabel 1.

No	Fraksi	Jumlah Noda	Rf	Warna Ekstrak
1	A	1	0,725	Kuning
2	B	2	0,690 dan 0,600	Kuning muda
3	C	1	0,580	Kuning muda

Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa fraksi A dan fraksi C positif terpenoid yaitu memberikan warna merah muda (positif diterpenoid) pada fraksi A dan warna ungu muda (positif triterpenoid) pada fraksi C setelah direaksikan dengan pereksi Lieberman-Burchard. Uji fitokimia dapat dilakukan dengan menggunakan pereaksi Lieberman-Burchard. Perekasi Lebermann-Burchard merupakan campuran antara asam setatanhidrat dan asam sulfat pekat. Hasil ini dipaparkan pada Tabel 2.

Nama Fraksi	Warna larutan sebelum direaksikan dengan pereaksi Liberman-Burchad	Warna larutan setelah direaksikan dengan pereaksi Liberman-Burchad	Keterangan
Fraksi A	Kuning	Merah  muda	Positif terpenoid (diterpenoid)
Fraksi B	Kuning muda	Hijau kebiruan	Negative terpenoid (steroid)
Fraksi C	Kuning muda	Ungu muda	Positif terpenoid(triterpenoid)

Fraksi yang positif terpenoid selanjutnya dilakukan uji aktivitas antibakteri. Dari hasil uji aktivitas antibakteri fraksi A memberikan daya hambat yang lebih baik sehingga fraksi A dilanjutkan ke tahap pemurnian. Hasil pemurnian menunjukkan noda tunggal. Hal ini dapat dikatakan fraksi A relative murni secara KLT. Isolat yang relatif murni diidentifikasi menggunakan kromatografi gas – spektroskopi massa. Kromatogram gas fraksi n-heksana positif terpenoid dan aktif antibakteri yang menunjukkan terdapatnya dua buah puncak dengan waktu retensi berturut-turut : 25,74 dan 21,93 menit. Berdasarkan data di atas senyawa tersebut mengandung dua buah senyawa.

Setelah difragmentasi, struktur phytadiene mengikuti pola fragmentasi senyawa pada puncak I, dengan demikian senyawa pada puncak I diduga sebagai senyawaphytadiene berdasarkan data Spektroskopi Massa, pola fragmentasi dan hubungan antara senyawa puncak I dengan phytol, phytadiene dan dodekane.

Berdasarkan data hasil penelusuran internet, terdapat struktur senyawa yang memiliki berat molekul m/z 336 dengan gugus dan pola fragmentasi yang memenuhi gugus dan pola fragmentasi senyawa pada puncak II, senyawa tersebut adalah 1,2-seco-cladiellan. Berdasarkan data di atas ditarik suatu kesimpulan yaitu senyawa puncak II diduga sebagai senyawa 1,2–seco–cladiellan, karena struktur senyawa ini memenuhi pola fragmentasi senyawa puncak II.

http://cacingpedia.blogspot.com/2011/12/metode-pemisahan-dengan-cara.html